Co je test PCR?
PCR test je laboratorní metoda používaná v molekulární biologii a medicíně. Test se používá pro přímou detekci – a charakterizaci – genetického materiálu. Metoda PCR je odborníky považována za snadno proveditelnou, univerzálně použitelnou a robustní.
V laboratoři se test PCR skládá ze dvou kroků. V prvním kroku je stávající genetický materiál amplifikován pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). To umožňuje zkoumat nejmenší stopy DNA. To je také důvod, proč PCR testy reagují tak citlivě.
Ve druhém kroku je genetický materiál separován podle jeho vlastností, „tříděn“ a tím charakterizován. Jinými slovy, je určena jemná struktura DNA.
Možných aplikací je mnoho: lékaři využívají PCR test například k vyšetření stěrů na přítomnost koronavirů, dárcovství krve na HIV nebo ke screeningu novorozenců na možná dědičná onemocnění. Pomocí PCR lze objasnit i bakteriální infekce – například patogenem tuberkulózy – nebo parazitární infekce (malárii).
Pomáhají také usvědčit pachatele v soudním lékařství na základě jejich genetických otisků prstů nebo se používají jako testy otcovství.
Jak dlouho je test PCR platný?
Výsledek testu PCR je obvykle platný 48 hodin od odběru vzorku.
Jak spolehlivý je test PCR?
PCR je osvědčená detekční metoda v molekulární diagnostice a medicíně. Je považován za tzv. zlatý standard s velmi nízkou chybovostí. Testy se vyznačují zejména velmi vysokou senzitivitou a specificitou.
Citlivost znamená spolehlivost, se kterou test najde genetický materiál, který má být detekován.
Specifičnost znamená jistotu, se kterou test určuje, že dotyčný genetický materiál není ve vzorku přítomen.
Kdy fungují testy PCR na infekci Sars-CoV-2?
PCR test detekuje koronavirovou infekci zpravidla dva až tři dny před a až 20 dní po nástupu příznaků. Dokonce i u infikovaných lidí, kteří zůstávají zcela bez příznaků, je test účinný v kritickém časovém okně, kdy mohou infikovat ostatní.
V jednotlivých případech je detekce možná i 60 dní po nástupu příznaků.
Možné zdroje chyb
Chybovost v procesu kopírování DNA je v praxi zanedbatelná. Přestože DNA polymerázy nejsou nikdy bezchybné, v postupu PCR testu téměř nehrají roli.
V praxi se potenciální zdroje chyb nacházejí spíše ve sběru vzorků: je proto důležité, aby výtěry prováděli vyškolení zdravotníci. Vzorky slin a kloktadla by mohly snížit přesnost testu, protože zde dochází k účinkům ředění.
Jak funguje test PCR?
Test PCR provádí například rodinný lékař nebo ve speciálních testovacích centrech. Nejprve lékaři nebo vyškolení zdravotníci odeberou vzorek. K testu se obvykle odebírá výtěr z horních cest dýchacích. To má obvykle podobu výtěru z úst nebo nosohltanu.
Možné je i kloktání oplachovým roztokem. Vzorek krve je pro detekci korony atypický – ale široce používaný například při novorozeneckém screeningu.
Bez ohledu na typ odebraného vzorku se genetický materiál nachází na vatovém tamponu, v oplachovacím roztoku nebo v kapce krve. Tento vzorek materiálu je odeslán do laboratoře, kde je izolován a purifikován.
PCR test je pak rozdělen do dvou kroků:
- PCR: V tomto kroku je amplifikováno množství výchozího genetického materiálu.
Krok 1: PCR – „polymerázová řetězová reakce“
„PCR“ je prvním ze dvou kroků: Zde se amplifikuje množství dostupné výchozí DNA. Je to proto, že genetický materiál lze analyzovat pouze tehdy, je-li k dispozici v dostatečném množství. Ve většině případů se jedná o lidskou DNA; v případě testů na koronavirus jde o virovou RNA.
Zkratka PCR znamená „polymerázová řetězová reakce“.
Co je potřeba pro PCR?
Výchozí DNA se umístí do reakční nádoby se speciálními látkami. Stávající genetický materiál slouží jako templát, který je zkopírován za přítomnosti určitých enzymů (Taq polymeráza) a určitých základních stavebních bloků DNA.
Proces kopírování probíhá v několika opakujících se chodech (cyklech).
Konkrétně se k sobě přidávají tyto látky:
- Počáteční DNA: Vzorek materiálu, který má být zkopírován.
- Základní stavební bloky DNA: Jsou to nukleobáze adenin, thymin, cytosin a guanin.
- DNA polymeráza: Enzym, který spojuje jednotlivé stavební bloky DNA a vytváří dobře definovaný řetězec DNA. Nově získaný pramen je zrcadlovým obrazem (doplňkem) původního výchozího materiálu.
- Primery: Skládají se z 16 až 24 párů bází a slouží jako výchozí pozice a startovací signál. Primery ukazují DNA polymerázu, ve které poloze (počáteční DNA) začíná proces kopírování.
Jak se provádí test PCR?
Nyní, když jsou v reakční nádobě přítomny všechny látky potřebné pro PCR, může začít vlastní proces kopírování genetického materiálu. To se spouští, řídí a opět zastavuje výhradně teplotou.
Reakční nádoba se proto postupně zahřívá nebo chladí na různé teploty. To se provádí pomocí speciálního zařízení známého jako termocykler. Celá reakce trvá asi jednu až dvě hodiny.
Jednotlivé kroky cyklu PCR jsou
- Denaturace dvouřetězců DNA: Vzorek se zahřeje na přibližně 90 stupňů Celsia. Tím se původní dvouvlákno DNA oddělí na dva samostatné (komplementární) jednoduché řetězce.
- Uchycení primerů: Teplota se sníží na lehce pod 60 stupňů Celsia. To způsobí, že se primery (dopředný primer, reverzní primer) připojí k definovaným pozicím na odpovídajících jednotlivých vláknech DNA.
Po dokončení cyklu se teplota opět zvýší na přibližně 90 stupňů Celsia – cyklus začíná znovu od začátku.
Metodu PCR lze použít k amplifikaci sekvencí DNA až do přibližně tří párů kilobází (kbp). To odpovídá přibližně 3,000 30,000 základním stavebním blokům DNA, které jsou vzájemně propojeny a tvoří „řetězec“. Pro srovnání: lidský genom uchovává plány a informace pro fungování buňky v přibližně třech miliardách párů bází – genom koronaviru se naproti tomu skládá z XNUMX XNUMX párů bází. PCR test proto může vždy amplifikovat a zkoumat pouze krátké úseky celkové DNA.
Rozhodující jsou primery
Výběr primerů je pro postup PCR zásadní. V diagnostice Sars-CoV-2 se například používá několik primerů (multiplexní PCR).
Testy Corona PCR tak hledají tři různé virové geny: To zvyšuje celkovou specificitu na téměř 99.99 %. To znamená, že při této vysoké míře úspěšnosti je pouze jeden falešně pozitivní test na 10,000 XNUMX testů (pokud jsou vzorky odebírány správně).
Kolik zkopírovaného genetického materiálu je nyní k dispozici?
Předpokládejme, že po prvním cyklu jsou přítomny dva identické dvouřetězce DNA.
Po každém cyklu se množství (zkopírovaného) genetického materiálu zdvojnásobí. Množství DNA tedy roste exponenciálně.
Lékaři obvykle tento proces opakují asi dvacetkrát až třicetkrát.
Obrazně řečeno to znamená, že i když je na začátku ve vzorku nalezen pouze jediný dvouřetězec DNA, po dvaceti cyklech je v reakční nádobě již milion identických kopií.
Co znamená hodnota Ct?
Počet proběhnutých cyklů PCR je indikován ve formě tzv. hodnoty Ct. „Ct“ je odvozeno z anglického výrazu „cycle threshold“. Tato hodnota Ct umožňuje učinit prohlášení o množství hledaného genetického materiálu.
S nízkou hodnotou Ct 20 je mnoho výchozího genetického materiálu. Pokud je však hodnota Ct vysoká – kolem 30 cyklů – je odpovídajícím způsobem málo DNA. Cyklus PCR se proto musí spouštět častěji.
Krok 2: Elektroforéza „Třídění podle velikosti“
Jakmile je k dispozici dostatek „obohaceného“ genetického materiálu, lze provést elektroforézu. V tomto procesu vědci využívají specifickou vlastnost DNA: její elektrický náboj.
Jednotlivé stavební bloky DNA jsou navzájem propojeny prostřednictvím (záporně) nabité kostry cukr-fosfát. Čím delší je konkrétní sekvence DNA, tím vyšší je její elektrický náboj.
To umožňuje zkoumat a charakterizovat genetický materiál. V praxi se neznámý vzorek obvykle vynese proti známé referenci na „startovní čáře“ a po určité době se vzájemně porovná.
Pokud je „rychlost migrace“ stejná pro obě sekvence, znamená to, že detekce je s největší pravděpodobností pozitivní: Detekce je velmi pravděpodobně pozitivní – gen, který hledáte, je obsažen ve vzorku.
Speciální případ koronaviru: příprava vzorku a RT-PCR
Detekce koronaviru je zvláštní případ. Sars-CoV-2 patří mezi takzvané RNA viry. To znamená, že genetický materiál Sars-CoV-2 je přítomen ve formě RNA (ribonukleové kyseliny).
RNA se liší od DNA pouze v několika ohledech. Mimo jiné je přítomen jako jeden řetězec a je založen na cukru ribóze namísto 2′-deoxyribózy. Nukleobáze thymin je také nahrazena uracilem jako čtvrtá báze.
Tato virová RNA musí být „přepsána“ do DNA před pravidelným PCR testem. Tento proces se nazývá reverzní transkripce (RT) – odtud termín RT-PCR. V rámci tohoto procesu se získá jeden řetězec cDNA („komplementární DNA“). V dalším kroku je jednovlákno cDNA doplněno druhým vláknem DNA se zrcadlovým obrazem.
Jak dlouho trvá, než se dostaví výsledek?
Po odeslání vzorku do laboratoře obvykle obdržíte výsledek do jednoho nebo dvou pracovních dnů. V testovacích centrech, která často zkoumají vzorky přímo na místě, to může trvat i několik hodin. Časové rozpětí závisí do značné míry na příslušném testovacím centru a jeho logistice.
I přes složité pracovní procesy jsou moderní laboratoře schopny provádět PCR testy s vysokou propustností. S prováděním testů pomáhají speciální automatizovaná zařízení.
Přesto je PCR test považován za poměrně „pomalou“, ale o to spolehlivější metodu detekce.
Co se stane, když je výsledek pozitivní?
Pokud je vzorek odebrán správně, pozitivní test PCR znamená, že je velmi vysoká pravděpodobnost, že testovaná osoba je infikována Sars-CoV-2.
Pokud u vás byla potvrzena nákaza koronavirem pomocí PCR testu, obdrží odbor ochrany veřejného zdraví oznámení o pozitivním výsledku testu od příslušné laboratoře. V takovém případě odbor veřejného zdraví nařídí izolaci nebo karanténu.
Jsem automaticky nakažlivý, když mám pozitivní test na PCR?
Obvykle ano. Ale ne vždy. Výsledek testu PCR by měl být vždy interpretován v kontextu. Pozitivní test v první řadě znamená, že máte virový materiál.
Někdy je užitečný doplňkový test na protilátky
V takových případech poskytuje jistotu test na protilátky, který potvrzuje platnost testu PCR. Nejlepší je probrat to se svým lékařem. Mohou vám pomoci správně interpretovat výsledek testu PCR.
Co dělat, když je výsledek negativní?
Negativní výsledek testu PCR s největší pravděpodobností znamená, že jste v době odběru vzorku neměli Covid-19, a proto v současné době nejste infekční. Můžete však být v rané fázi infekce.
Koronové infekce lze obvykle detekovat až od druhého nebo třetího dne po infekci. Výsledkem tedy není volný průchod. Měli byste proto nadále dodržovat pravidla sociálního odstupu a hygienická pravidla a nadále nosit roušku FFP2 – pro svou ochranu i ochranu ostatních.
PCR test pro děti
Test PCR pro děti se neliší od testu PCR pro dospělé. Sběr vzorků i interpretace výsledků platí pro děti i dospělé.
Jaká jsou rizika PCR testu?
PCR test nepředstavuje žádná fyzická rizika. Pouze odběr vzorku výtěrem z nosohltanu je některými lidmi vnímán jako rušivý nebo nepříjemný.
Kolik stojí PCR test?
Upozornění: Pokud jste se doma otestovali a dostali jste pozitivní výsledek, měli byste si ihned telefonicky domluvit schůzku se svým praktickým lékařem. Váš lékař s vámi po telefonu probere další postup.
Případně je nejlepší zavolat na číslo 116 117 a zaregistrovat se k testu PCR. V ideálním případě byste měli zůstat doma až do potvrzovacího testu, abyste ochránili sebe i ostatní.
