Technika patch-clamp je název pro metodu elektrofyziologického měření. Umožňuje měřit iontové proudy jednotlivými kanály v plazmové membráně.
Co je technika patch-clamp?
Technika patch clamp nebo metoda patch clamp patří do elektrofyziologie, což je odvětví neurofyziologie zabývající se elektrochemickým přenosem signálů v nervový systém. Pomocí této metody je možné vizualizovat jednotlivé iontové kanály v buněčná membrána tělesné buňky. To zahrnuje měření proudů několika pikoampérů. Technika patch-clamp byla poprvé popsána v roce 1976 německým biofyzikem Erwinem Neherem a německým lékařem Bertem Sakmannem. Tito dva vědci obdrželi v roce 1991 Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu za vývoj techniky svorkových záplat. Elektrofyziologický výzkum tak prakticky způsobil revoluci technikou patch-clamp, protože otevřel možnost pozorování elektrického chování na membráně Proteinů jednotlivce molekuly. Termín patch pochází z anglického jazyka a znamená „patch“. Jedná se o malou část membrány pod pipetou s náplastí, která se používá jako měřicí elektroda. Během procesu měření je membránová náplast fixována nebo upnuta (k upnutí) na specifikované potenciály.
Funkce, účinek a cíle
Technika patch-clamp je metoda elektrofyziologické analýzy. Je založen na biologické skutečnosti, že buňky mají velké množství pórů a iontových kanálů. Různé koncentrace iontů nebo náboje se vyskytují uvnitř i vně každé buňky, což závisí na fyziologickém stavu buňky. Lipidová dvojvrstva membrány není propustná voda molekuly stejně jako ionty. Nicméně výměna nabitých částic probíhá napříč buněčná membrána v nepravidelných intervalech. Důvodem je závislost iontových kanálů na napětí. Pokud je dosaženo určitého membránového potenciálu, kanály se otevírají podle principu „všechno nebo nic“. To je přesně místo, kde přichází technika patch clamp. Tímto způsobem se měřící pipeta posune na iontový kanál, aniž by pronikla do buněčná membrána. Tímto způsobem lze přesně určit místní elektrický potenciál. Svodovým proudům, které by mohly ovlivnit výsledek měření, lze obvykle zabránit elektricky extrémně těsným spojením mezi hranou pipety a buněčnou membránou. Metoda patch kleští je založena na technice napěťových kleští. Tato technika byla vyvinuta ve třicátých letech 1930. století americkým biofyzikem Kennethem Stewartem Colem (1900-1984) k měření proudů v nervových buňkách, které jsou neporušené. V napěťové svorce dochází k vložení dvou elektrod do článku, aby se zajistilo povelové nebo přidržovací napětí. Současně se používá další elektroda k zaznamenávání proudů, které se vyskytují přes membránu. Pokud neurofyziologové chtějí vědět o toku elektrických proudů specifickými oblastmi a nervová buňka membrány, používají techniku svorky. K tomu používají pipetu z jemného skla, která je umístěna na vnější straně buňky. Podtlak lze vytvořit jeho nasátím pomocí injekční stříkačky. Tento postup způsobí, že se membrána na příslušném místě mírně vyboulí. Podtlak zajišťuje, že je sklo připojeno k membráně. To má za následek elektrickou izolaci malé skvrny na membráně v pipetě od zbytku membrány. K měření elektrických proudů používají neurofyziologové zesilovač patch-clamp. Jedná se o speciální měřicí zařízení. V ideálním případě může vědec použít zařízení k získání informací o elektrických vlastnostech jednotlivých iontových kanálů. Iontové kanály regulují například přítok a odtok sodík ionty, které jsou v nervových buňkách kladně nabité. Vyšetřování probíhá na buňkách lidí, rostlin nebo zvířat. Metoda patch-clamp se obvykle provádí na měřicí stanici, která zahrnuje různá zařízení. Na měřícím stole tlumeném vibracemi je takzvaná Faradayova klec, která slouží jako elektrický štít. Kromě toho je k dispozici optický mikroskop včetně mikromanipulátoru, který uvede pipetu s náplastí na místo. Kromě toho je držák pipety spojen s předzesilovačem, zatímco držák vzorku je připojen k lázňové elektrodě. Patch klešťový zesilovač funguje tak, že zesiluje signál předzesilovače. K dispozici je také monitor, který sleduje DUT i patchovou pipetu. Ve většině případů je u měřícího stolu k dispozici počítač a několik zařízení pro ukládání dat, které umožňují digitální záznam.
Rizika, vedlejší účinky a nebezpečí
S technikou patch-clamp nejsou spojena žádná rizika. Například buňky lidí, zvířat nebo rostlin nejsou zkoumány, dokud nejsou odstraněny. Neomezený přístup k vnější buněčné membráně existuje zřídka. Z tohoto důvodu je často nutné buňky připravit na metodu patch-clamp. Po naplnění je pipeta s náplastí uzavřena v mikromanipulátoru. Ten je připojen k zesilovači svorek patchů a jemně přitlačen na neporušenou buňku. Proces lze sledovat pomocí monitoru nebo mikroskopu. Pod pipetou je kousek membrány, který se nazývá membránová náplast. Mírný podtlak vytvořený na zadním konci pipety poskytuje silné spojení mezi pipetou a membránou. Tento proces vede k vytvoření elektrického odporu mezi externím roztokem a vnitřkem pipety několika gigaohmů. Vědci to také nazývají „gigaseal“, což umožňuje dosáhnout konfigurace metody patch-clamp připojené k buňce. Proud protékající iontovým kanálem v náplasti také protéká obsahem pipety kvůli vysokému gigaseaálnímu odporu. Elektroda připojená k zesilovači je ponořena do roztoku pipety, což umožňuje měřit aktivity jednotlivých iontových kanálů v propojovací membráně.
