Polymerázová řetězová reakce představuje postup z molekulární biologie, který duplikuje řezy z genetického materiálu (deoxyribonukleová kyselina, DNA). Miliony identických kopií jsou vyrobeny z nepatrného množství DNA. Tímto způsobem jsou k dispozici množství, která jsou dostatečná pro různá vyšetřování.
Co je polymerázová řetězová reakce?
Polymerázová řetězová reakce představuje metodu z molekulární biologie, která duplikuje části z genetického materiálu (deoxyribonukleová kyselina, DNA). Termín polymerázová řetězová reakce (PCR) popisuje in vitro (latinsky: ve skle) reakci pomocí enzymu, polymerázy (DNA polymerázy), která vede k duplikaci určitých gen sekvence. Produkt reakce je také výchozím materiálem pro nový cyklus této reakce. Počet molekuly zdvojnásobí a zároveň slouží jako šablona pro nový cyklus. Toto se označuje jako exponenciální násobení. Probíhá v laboratoři velkou rychlostí několika minut, podobně jako řetězová reakce. Tento laboratorní proces napodobuje duplikaci genetické informace (DNA), ke které dochází v přirozených podmínkách během replikace. Za objevitele tohoto procesu je považován americký chemik KB Mullis. V roce 1983 představil tento proces syntézy DNA a o deset let později získal Nobelovu cenu za chemii.
Funkce, účinek a cíle
V živých organismech je DNA v chromozomy má délku, kterou nelze amplifikovat pomocí PCR. Místo toho se používá k zesílení definované části. To mohou být geny, specifická část a gen, nebo regiony, do kterých nejsou přepsány Proteinů, tj. nekódují. Tyto sekce obvykle neobsahují více než tři tisíce párů bází, ve srovnání s přibližně dvakrát třemi miliardami párů bází na sadu chromozomy u lidí. Polymerázová řetězová reakce vyžaduje jednořetězcový nebo dvouřetězcový řetězec DNA, jehož struktura musí být alespoň částečně známa. Kromě enzymu, polymerázy, se používají dva primery. Jedná se o stavební kameny DNA, které fungují jako počáteční a koncový bod. Jsou charakterizovány sekvencí, která přesně odpovídá oblasti, která má být amplifikována. V laboratoři se polymerázová řetězová reakce provádí v programovatelném zahřívacím bloku. Potřebné složky, jako je polymeráza, primer, stavební kameny pro vytvoření nového řetězce (deoxyribonukleosid trifosfáty) a magnézium ionty se přidají dohromady v pufrovacím roztoku. Teplotně-časový program pro reakci začíná denaturací při teplotě nad 94 ° C. V tomto procesu je dvouvláknová DNA štěpena a je přítomna v jednovláknové formě. V dalším kroku, při asi 70 ° C, je primer navázán na gen sekvence a tvoří výchozí bod pro enzymovou reakci. Odtud polymeráza syntetizuje komplementární vlákno. Poté začíná nový cyklus, který se opět skládá ze tří kroků denaturace, vazby primerů a syntézy řetězce DNA. Polymerázová řetězová reakce se používá ve soudním lékařství, klinické diagnostice a klinickém výzkumu. Ve forenzní vědě je DNA extrahována z kůže, slina, vlasy, sperma nebo krev z míst činu a po zesílení porovnány se známými vzorky a použity k identifikaci konkrétních osob. Pomocí tohoto genetického otisku prstu lze otcovství vyjasnit také v modifikovaném přístupu. Při objasňování nemocí se k ověření zúčastněných genů používá polymerázová řetězová reakce. Některá bakteriální onemocnění lze klasifikovat rozpoznáním specifických sekvencí. Virová onemocnění lze charakterizovat transformací a amplifikací virové DNA nebo RNA. v krev screening, je možné detekovat zánět jater nebo nemoci zprostředkované HIV ve velmi rané fázi. V diagnostice nádorů se používá k identifikaci nádorových buněk. To umožňuje klasifikovat nádor, posoudit průběh onemocnění, úspěšnost terapie a prognóza. Ve výzkumu se polymerázová řetězová reakce používá k identifikaci genů spojených s různými chorobami. U genového klonování, které není stejné jako klonování organismu, je gen amplifikován před přenosem do jiných organismů ve vektoru (latinsky: cestovatel, nosič ). Mohou fungovat jako modely pro lepší studium nemocí nebo pro produkci Proteinů které lze použít jako drogy.
Rizika a nebezpečí
Polymerázová řetězová reakce má obrovský potenciál při detekci nepatrného množství DNA. Aby bylo možné využít množství možností a chránit se před závažnými chybami, je třeba vzít v úvahu určité předpoklady a různé zdroje chyb. Mohou být amplifikovány pouze části genetického materiálu, jejichž sekvence je alespoň částečně známa. Zcela neznámé sekvence nelze touto metodou amplifikovat. Produkty zesílení lze následně vizualizovat. Pokud očekávaný signál není viditelný, přestože hledaná sekvence byla přítomna, je přítomen falešně negativní výsledek. Nejčastěji je to výsledek neoptimalizovaných nebo špatně optimalizovaných reakčních podmínek. Ty musí být určeny jako funkce cílové sekvence. Za tímto účelem se testují různé teplotní a časové profily, sekvence primerů a množství, jakož i koncentrace dalších látek v reakční směsi. Falešně pozitivní výsledky se projevují jako signály, které nelze přiřadit požadovanému produktu. Hlavní problémy jsou způsobeny kontaminací DNA pocházející od vyšetřovatele nebo ze zdroje jiného, než který má být analyzován. DNA bakteriálního původu také ovlivňuje výsledek polymerázové řetězové reakce. Nosením rukavic a velkou péčí lze těmto chybám zabránit a je možné formulovat spolehlivé závěry o zesílených produktech.
