Hybridizace in situ je metoda pro detekci chromozomálních aberací. Zahrnuje specifické označení chromozomy s moukou barviva a jejich vazba na sondu DNA. Tato technika se používá pro prenatální diagnostiku genetických mutací.
Co je hybridizace in situ?
Hybridizace in situ zahrnuje značení specifické chromozomy s moukou barviva a jejich vazba na sondu DNA. Tato technika se používá pro prenatální diagnostiku gen mutace. In situ hybridizace nebo fluorescence in situ hybridizace zahrnuje molekulárně genetickou detekci nukleové kyseliny z RNA nebo DNA ve specifických tkáních nebo buňkách. Normálně se tento typ diagnostiky používá k detekci strukturální nebo numerické chromozomální abnormality v těhotenství. K tomuto účelu se používá uměle vyrobená sonda, která sama sestává z nukleové kyseliny. Poté se váže na nukleové kyseliny v organismu párováním bází. Tato vazba je označována termínem hybridizace. Detekce se provádí na živé struktuře pacienta, a proto odpovídá detekci in situ. Od toho je třeba odlišit metody in vitro, při nichž detekce probíhá ve zkumavce. Metodu vyvinuli ve 20. století vědci Joe Gall a Mary Lou Pardue. Technika se od té doby vyvinula. Například když byly poté použity radioaktivní sondy, sondy značené fluorescencí s kovalentní vazbou na značení molekuly se dnes používají.
Funkce, účinek a cíle
In situ hybridizace se obvykle používá k detekci chromozomálních aberací, chromozomálních abnormalit, které nelze detekovat na karyogramu. Metoda se tedy používá vždy, když se v průběhu mají určovat dědičné choroby těhotenství. Vzhledem k tomu, že chromozomální aberace jsou problémem, který by se dnes neměl podceňovat, se aplikace metody postupem času zvýšila. Hybridizace se provádí pomocí nativních buněk z matky plodová voda. Základem této techniky je navázání barevně značené sondy na fragmenty DNA. Díky vazbě lze mikroskop později použít k vyhodnocení počtu kopií, protože jednotlivé kopie vydávají světelný signál a lze je tak zviditelnit pod mikroskopem. Existují různé postupy. Buď se analýza provede okamžitě po navázání. V tomto případě se použije fluorescenční barvivo, jako je biotin je použit, který je navázán přímo na sondu DNA. V nepřímé metodě in situ hybridizace nelze analýzu provést bezprostředně po hybridizaci, protože fluorescenční látky se mohou vázat na sondu až po hybridizaci. Tato nepřímá metoda se běžněji používá než přímá metoda, protože je považována za citlivější. Mezi techniky patří chromosomově specifické centrometrické sondy DNA, lokusově specifické sondy DNA, chromosomově specifické sondy knihovny DNA a srovnávací hybridizace genomu. Chromozomově specifické centromérové sondy DNA lze použít k detekci chromozomálních numerických abnormalit. To znamená, že se primárně používají při duplikování nebo odstranění chromozomy jsou podezřelí. Lokálně specifické sondy DNA jsou vhodné zejména pro detekci minimálních mutací, které nelze detekovat na karyogramu. Sonda knihovny DNA specifická pro chromozomy se používá zejména k detekci inzercí a translokací. Srovnávací hybridizace genomu je na druhé straně komplexní analýzou ztrát a zisků v chromozomálním materiálu. Dnes má hybridizace in situ velký význam v diagnostice různých chromozomálních mutací. V diagnostice Downův syndromnapříklad sondy se vážou na chromozom 21. Za tímto účelem se obvykle používají sondy specifické pro chromozomy, které lze použít v případě podezření na toto onemocnění. Podezření může vzniknout například v případě, že rodiče již dříve porodili dítě s tímto onemocněním a ultrazvuk obrázek je nápadný. Pokud existuje spíše trojitá než dvojitá vazba, což má za následek trojitý barevný signál, je diagnóza považována za potvrzenou.
Rizika, vedlejší účinky a nebezpečí
Na rozdíl od PCR je například hybridizace in situ mnohem méně náchylná ke kontaminaci. Kromě toho je doba potřebná k provedení procedury nesmírně kratší. Avšak zejména proto, že embrya tvoří chromozomální obrazce, nelze použít žádný z přítomných obrazců, aby bylo možné s jistotou odvodit zbytek chromozomálních vzorků. distribuce a tím i genetický stav ostatních buněk. Barevné signály se mohou také překrývat nebo zůstat neviditelné z jiných důvodů. Hybridizace in situ tedy jako diagnostický nástroj během těhotenství je relativně náchylný k chybám. Mohou nastat chybné diagnózy a rodiče se mohou rozhodnout proti zdravému embryo. Aby se snížila náchylnost k chybám in situ hybridizace, měly by být současně vyšetřeny alespoň dvě embryonální buňky. Souběžným zkoumáním dvou buněk nyní existuje pouze zanedbatelné riziko nesprávné diagnózy. Rodiče se tedy v takovém případě mohou spolehnout na diagnózu. Hybridizace in situ není nabízena každé těhotné ženě, ale pouze ženám z rizikové skupiny. Těhotným ženám však tento typ diagnózy není odepřen na vlastní žádost. Abnormální ultrazvuk nálezy nebo abnormální sérum mohou přimět lékaře, aby nabídl diagnostický postup. Dnes lze hybridizaci in situ použít k diagnostice velké části chromozomálních aberací, ale v žádném případě ne všech. Hybridizace in situ proto nikdy nesmí být prováděna samostatně, ale musí být vždy použita ve spojení s konvenčním chromozomovým testem. V tomto postupu hraje důležitou roli péče o těhotnou ženu. Před analýzou proto proběhne s nastávající matkou důkladná diskuse o diagnostické metodě, která ji informuje o rizicích, možnostech a omezeních této techniky.
