Poznámka: Následující článek byl zahrnut do jiných konvenčních terapií, protože pro experimentální metody molekulární biologie mimo humánní medicínu ještě není k dispozici samostatná část. Metoda CRISPR / Cas je molekulárně biologická metoda pro cílené dělení i modifikaci DNA (editace genomu; gen nůžky). V roce 1987 vědci objevili dříve nepozorovanou adaptivní imunitní systém v E. coli. Toto je založeno na takzvaných CRPSPR sekvencích (shlukovaných pravidelně rozložených krátkých palindromických opakováních) v DNA. E. coli integruje DNA bakteriofágů (skupiny viry které se specializují na bakterie jako hostitelské buňky) sekvenci CRSPR vlastní DNA, čímž přepisuje crRNA (přepis DNA na RNA). CrRNA sestává jak z mezerníkové, tak z opakované sekvence. Distanční sekvence jsou sekvence „extrahované“ z bakterie. Takzvaná trRNA (tracrRNA) se váže na pojmenované opakované sekvence. Přijímá enzym CAS9. Nyní je přítomen komplex - komplex crRNA: tracrRNA: Cas9 - který je schopen vázat bakteriofágovou DNA komplementární k vesmírným sekvencím crRNA. Jako takzvaná endonukleáza (enzym štěpící DNA, tedy restrikční enzym) štěpí CAS9 virovou DNA dvouřetězcovým způsobem, což nakonec vede k neschopnosti replikace (tj. Žádná další replikace a následně žádná další integrace). Již více než deset let se tento postup používá s důrazem na výzkum úpravy genomu. Popsaný „crRNA: tracrRNA: komplex Cas9“ je univerzálně použitelný pro rostliny a zvířata a umožňuje odstranění (vypuštění) a konečné umlčení genů. Již déle než 5 let se v zemědělství a potravinářských plodinách objevuje použití mimo toleranci k toleranci vůči suchu a ke zvýšení imunizace proti virovým patogenům. Postup by mohl být později použit v humánní medicíně. Od roku 2020 poprvé existuje léčebný terapeutický přístup pro vrozené onemocnění srdce defekt (vitium) u dětí. Vitium je součástí komplexního dědičného onemocnění Noonanova syndromu (autozomálně recesivní nebo autozomálně dominantní dědičnost). Po dešifrování kauzálních variant LZTR1 gen, vhodná genová korekce generovaných indukovaných pluripotentních kardiomyocytů (srdce svalové buňky) z kmenových buněk dvojčat. The gen reguluje základní signální dráhy pro diferenciaci a růst buněk.
Před touto potenciální terapií v humánní medicíně
Molekulárně genetické testování dědičných poruch u rodičů včetně komplexního genetické poradenství.
Postup
Postup je obdobný jako u obranného mechanismu E. coli popsaného v imunitní systém. V tomto procesu může být mezerníková část crRNA modifikována tak, aby štěpila sekvenčně specifickou dvouvláknovou komplementární DNA, což vede k cíleným delecím. Chemicky modifikovaná molekula trRNA: crRNA se nazývá guideRNA. To vyžaduje dva různé crRNA: tracrRNA: Cas9 komplexy k připojení ke dvěma místům na DNA. Po odstranění fragmentu DNA dochází pomocí ligas k vazbě 2. fragmentů DNA za pomoci enzymu. To se liší od pouhého štěpení sekvence DNA jako v bakterii. V průběhu let byly přidány základní techniky modelování. Umožňují nejen delece v řetězci DNA, ale také přidání (inzerce) nových nukleotidů DNA. Nejslibnější modifikací je prvotřídní editace. Zde po deleci a tím odstranění fragmentu DNA následuje vložení nového fragmentu DNA. Tzv. PegRNA (hlavní editační průvodce RNA) je zde k dispozici jako přepis DNA, která má být vložena. Pomocí reverzní transkriptázy je pegRNA transkribována do DNA a inkorporována do DNA, opět pomocí ligáz. Protein CAS9 požadovaný pro tento proces generuje jednořetězcové místo dvouřetězcových řezů. To umožňuje, aby byl nový fragment DNA vložen s přesným uložením do řezaného řetězce DNA s jeho vyčnívajícími konci. Nová modifikace je zásadní pro budoucí výměnu „patologické“ sekvence DNA za „nepatologickou“ v souvislosti s dědičným onemocněním.
Po terapii
Znovu se provádí screening genomu, aby se potvrdila úspěšnost úpravy genomu.
Možné komplikace
Kvůli možným neshodám bází guideRNA mohou nastat mimocílové účinky, tj. Vazba na nežádoucím místě. Mohou způsobit bodové mutace (změny báze), inzerce (začlenění dalších nukleotidů nebo sekvencí DNA do sekvence DNA), delece (ztráta ...), translokace (změna polohy DNA) a inverze (přítomnost segmentu DNA otočeného 180 stupňů). Enzym CAS9 se neřeže na požadovaném místě ve všech případech. Zvýšení specificity však již bylo dosaženo změnami designu proteinů. Také spojením CAS9 s endonukleázou Fokl, také odvozenou z bakterie, specificita mohla být zvýšena na 1: 10,000 1 (bez dalších úprav, pouze specificita až 2: XNUMX).
